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FAB-CRISPR：基于抗生素抗性的高效哺乳动物细胞基因编辑技术

摘要

文章提出了一种名为FAB-CRISPR的高效基因编辑方法，通过在同源定向修复（HDR）模板中整合抗生素抗性标记，显著提高了哺乳动物细胞中蛋白质标记的敲入效率。该方法支持N端和C端标记，适用于多种应用场景，如活细胞显微成像和邻近标记蛋白质组学。实验结果表明，FAB-CRISPR在多种细胞系中实现了接近100%的编辑效率，并通过Western blot、测序和显微成像验证了标记蛋白的表达和功能。该方法为基因编辑研究提供了一种快速、可靠的解决方案。

1. 引言

CRISPR-Cas9技术已成为基因编辑的重要工具，但同源定向修复（HDR）效率低限制了其在蛋白质标记中的应用。文章提出了一种名为FAB-CRISPR的创新方法，通过将抗生素抗性标记整合到HDR模板中，显著提高了基因编辑效率。该方法简化了N端和C端标记的流程，适用于多种下游应用，如活细胞成像和蛋白质功能研究。

2. 方法

2.1 FAB-CRISPR设计

FAB-CRISPR的核心是包含抗生素抗性标记的HDR模板。设计过程分为以下步骤：

gRNA设计：通过Benchling平台选择靶向基因N端或C端的gRNA，确保切割位点靠近标记插入位置。
HDR模板构建：合成包含左右同源臂（各500 bp）的HDR质粒，并在同源臂之间插入抗生素抗性标记和蛋白质标签（如Halo、SNAP或StayGold）。

2.2 细胞转染与筛选

将gRNA表达质粒（pX330）和HDR模板共转染至目标细胞（如HeLa细胞），随后通过抗生素筛选富集编辑成功的细胞。对于N端标记，需额外转染EGFP-Cre质粒以切除抗生素抗性标记。

3. 结果

实验结果显示，FAB-CRISPR在多种哺乳动物细胞系（如U2OS、Jurkat T细胞等）中实现了高效的基因编辑：

C端标记：编辑效率接近100%，无需额外步骤。
N端标记：通过EGFP-Cre切除抗性标记后，编辑效率可达80%。

Western blot和测序分析证实了标记蛋白的正确表达，活细胞成像进一步验证了其定位和功能。

4. 讨论与结论

FAB-CRISPR通过整合抗生素抗性标记，显著提高了HDR效率，为基因编辑研究提供了一种高效、可靠的方法。其模块化设计支持多种标签和抗性标记的组合，适用于广泛的应用场景。未来可通过优化gRNA设计和转染条件进一步提升编辑效率。